oleh:IRMA RAHMAYANI
BAB I
PENDAHULUAN
Kromatografi
adalah suatu istilah umum yang digunakan untuk bermacam-macam teknik pemisahan
yang didasarkan atas partisi sampel diantara suatu rasa gerak yang bisa berupa
gas ataupun cair dan rasa diam yang juga bisa berupa cairan ataupun suatu
padatan. Penemu Kromatografi adalah Tswett yang pada tahun 1903, mencoba
memisahkan pigmen-pigmen dari daun dengan menggunakan suatu kolom yang berisi
kapur (CaSO4).
lstilah kromatografi diciptakan oleh Tswett untuk melukiskan daerah-daerah yang
berwarna yang bergerak kebawah kolom. Pada waktu yang hampir bersamaan, D.T.
Day juga menggunakan kromatografi untuk memisahkan fraksi-fraksi petroleum,
namun Tswett lah yang pertama diakui sebagai penemu dan yang menjelaskan
tentang proses kromatografi.
Penyelidikan
tentang kromatografi kendor untuk beberapa tahun sampai digunakan suatu teknik
dalam bentuk kromatografi padatan cair (LSC). Kemudian pada akhir tahun 1930 an
dan permulaan tahun 1940 an, kromatografi mulai berkembang. Dasar kromatografi
lapisan tipis (TLC) diletakkan pada tahun 1938 oleh Izmailov dan Schreiber, dan
kemudian diperhalus oleh Stahl pada tahun 1958. Hasil karya yang baik sekali
dari Martin dan Synge pada tahun 1941 (untuk ini mereka memenangkan Nobel)
tidak hanya mengubah dengan cepat kroinatografi cair tetapi seperangkat umum
langkah untuk pengembangan kromatografi gas dan kromatografi kertas. Pada tahun
1952 Martin dan James mempublikasikan makalah pertama mengenai kromatografi
gas. Diantara tahun 1952 dan akhir tahun 1960 an kromatografi gas dikembangkan
menjadi suatu teknik analisis yang canggih.
Kromatografi cair, dalam praktek
ditampilkan dalam kolom gelas berdiameter besar, pada dasamya dibawah kondisi
atmosfer. Waktu analisis lama dan segala prosedur biasanya sangat membosankan.
Pada akhir tahun 1960 an, semakin banyak usaha dilakukan untuk pengembangan
kromatografi cair sebagai suatu teknik mengimbangi kromatografi gas. High
Performance Liquid Chromatography (HPLC) atau Kromatografi Cair Penampilan
Tinggi atau High Preformance = Tekanan atau Kinerja Tinggi, High Speed =
Kecepatan Tinggi dan Modern = moderen) telah berhasil dikembangkan dari usaha
ini. Kemajuan dalam keduanya instrumentasi dan pengepakan kolom terjadi dengan
cepatnya sehingga sulit untuk mempertahankan suatu bentuk hasil keahlian
membuat instrumentasi dan pengepakan kolom dalam keadaan tertentu. Tentu saja,
saat ini dengan teknik yang sudah matang dan dengan cepat KCKT mencapai suatu
keadaan yang sederajat dengan kromatografi gas.
BAB II
ISI
II.1. Pengertian HPLC
HPLC
adalah alat yang sangat bermanfaat dalam analisis. Bagian ini menjelaskan
bagaimana pelaksanaan dan penggunaan serta prinsip HPLC yang sama dengan
kromatografi lapis tipis dan kromatografi kolom.
HPLC secara mendasar merupakan perkembangan tingkat tinggi
dari kromatografi kolom. Selain dari pelarut yang menetes melalui kolom dibawah
grafitasi, didukung melalui tek anan
tinggi sampai dengan 400 atm. Ini membuatnya lebih cepat.
HPLC memperbolehkan penggunaan partikel yang berukuran
sangat kecil untuk material terpadatkan dalam kolom yang mana akan memberi luas
permukaan yang lebih besar berinteraksi antara fase diam dan molekul-molekul
yang melintasinya. Hal ini memungkinkan pemisahan yang lebih baik dari komponen-komponen
dalam campuran.
Perkembangan yang lebih luas melalui kromatografi kolom
mempertimbangkan metode pendeteksian yang dapat digunakan. Metode-metode ini
sangat otomatis dan sangat peka.
II.2. Injeksi sampel
Injeksi sample
seluruhnya otomatis dan anda tidak akan mengharapkan bagaimana mengetahui apa
yang terjadi pada tingkat dasar. Karena proses ini meliputi tekanan, tidak sama
halnya dengan kromatografi gas (jika anda telah mempelajarinya).
II.3. Waktu
retensi
Waktu yang dibutuhkan oleh senyawa
untuk bergerak melalui kolom menuju detektor disebut sebagai waktu
retensi. Waktu retensi diukur berdasarkan waktu dimana sampel
diinjeksikan sampai sampel menunjukkan ketinggian puncak yang maksimum dari
senyawa itu.
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
Senyawa-senyawa yang berbeda memiliki waktu retensi yang berbeda. Untuk beberapa senyawa, waktu retensi akan sangat bervariasi dan bergantung pada:
- tekanan yang digunakan (karena itu akan berpengaruh
pada laju alir dari pelarut)
- kondisi dari fase diam (tidak hanya terbuat dari
material apa, tetapi juga pada ukuran partikel)
- komposisi yang tepat dari pelarut
- temperatur pada kolom
II.4.
Kelebihan KCKT
Kromatografi Cair
Kinerja Tinggi (KCKT) atau High Pressure Liquid Chromatography (HPLC) merupakan
salah satu metode kimia dan fisikokimia. KCKT termasuk metode analisis terbaru
yaitu suatu teknik kromatografi dengan fasa gerak
cairan
dan fasa diam cairan atau padat. Banyak kelebihan metode ini jika dibandingkan
dengan metode lainnya (Done dkk, 1974; Snyder dan Kirkland, 1979; Hamilton dan
Sewell, 1982; Johnson dan Stevenson, 1978). Kelebihan itu antara lain:
• mampu
memisahkan molekul-molekul dari suatu campuran
• mudah
melaksanakannya
• kecepatan
analisis dan kepekaan yang tinggi
• dapat
dihindari terjadinya dekomposisi / kerusakan bahan yang dianalisis
• Resolusi yang
baik
• dapat
digunakan bermacam-macam detektor
• Kolom dapat
digunakan kembali
• mudah
melakukan "sample recovery"
II.5.
Jenis – jenis Kromatografi
II.5.1.
Kromatografi padatan cair (LSC)
Teknik
ini tergantung pada teradsorpsinya zat padat pada adsorben yang polar seperti
silika gel atau alumina. Kromatografi lapisan tipis (TLC) adalah salah satu
bentuk dari LSC. Dalam KCKT kolom dipadati atau dipak dengan partikel-partikel
micro or macro particulate or pellicular (berkulit tipis 37 -44 μ).Sebagian
besar dari KCKT sekarang ini dibuat untuk mencapai partikel-partikel
microparticulate lebih kecil dari 20μ . Teknik ini biasanya digunakan untuk zat
padat yang mudah larut dalam pelarut organik dan tidak terionisasi. Teknik ini
terutama sangat kuat untuk pemisahan isomer-isomer.
II.5.2.
Kromatografi partisi
Teknik
ini tergantung pada partisi zat padat diantara dua pelarut yang tidak dapat
bercampur salah satu diantaranya bertindak sebagai rasa diam dan yang lainnya
sebagai fasa gerak. Pada keadaan awal dari kromatografi cair (LSC), rasa
diamnya dibuat dengan cara yang sama seperti pendukung pada kromatografi gas
(GC). Fasa diam (polar atau nonpolar) dilapisi pada suatu pendukung inert dan
dipak kedalam sebuah kolom. Kemudian rasa gerak dilewatkan melalui kolom.
Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi cair cair (LLC)
Untuk
memenuhi kebutuhan akan kolom-kolom yang dapat lebih tahan lama, telah
dikembangkan pengepakan fase diam yang berikatan secara kimia dengan pendukung
inert. Bentuk kromatografi partisi ini disebut kromatografi fase terikat (BPC =
Bonded Phase Chromatography). BPC dengan cepat menjadi salah satu bentuk yang
paling populer dari KCKT. Kromatografi partisi (LLC dan BPC), disebut
"fase normal" bila fase diam lebih polar dari fase gerak dan
"fase terbalik" bila fase gerak lebih polar dari pada fase diam.
II.5.3.
Kromatografi penukar ion (IEC)
Teknik
ini tergantung pada penukaran (adsorpsi) ion-ion di antara fase gerak dan
tempat-tempat berion dari pengepak. Kebanyakan mesin-mesin berasal dari
kopolimer divinilbenzen stiren dimana gugus-gugus fungsinya telah ditambah.
Asam sulfonat dan amin kuarterner merupakan jenis resin pilihan paling baik
untuk digunakan Keduanya, fase terikat dan resin telah digunakan. Teknik ini
digunakan secara luas dalam life sciences dan dikenal untuk pemisahan asam-asam
amino. Teknik ini dapat dipakai untuk keduanya kation dan anion.
II.5.4.Kromatografi
eksklusi
Teknik
ini unik karena dalam pemisahan didasarkan pada ukuran molekul dari zat padat.
Pengepak adalah suatu gel dengan permukaan berlubang-lubang sangat kecil
(porous) yang inert. Molekul-rnolekul kecil dapat masuk dalarn jaringan dan ditahan
dalam fase gerak yang menggenang (stagnat mobile phase). Molekul- molekul yang
lebih besar, tidak dapat masuk kedalam jaringan dan lewat melalui kolom tanpa
ditahan.
Kromatografi
eksklusi rnernpunyai banyak nama, yang paling umum disebut permeasi gel (GPC)
dan filtrasi gel. Apapun namanya, mekanismenya tetap sama. Dalam bidang
biologi, Sephadex, suatu Cross-linked dextran gel, telah digunakan secara luas,
hanya pengepak keras dan semi keras (polistiren, silika, glass) yang digunakan
dalam KCKT. Dextran gel lunak tidak dapat menahan kinerja diatas 1 atau 2
atmosfer. Tenik ini dikembangkan untuk analisis polimer-polimer dan bahan-bahan
biologi, terutama digunakan untuk rnolekul-molekul kecil.
II.6.Komponen
KCKT
Komponen-komponen
penting dari KCKT dapat dilihat. Diagram Blok KCKT berikut ini
II.6.1. Pompa
(Pump)
Fase
gerak dalam KCKT adalah suatu cairan yang bergerak melalui kolom. Ada dua tipe
pompa yang digunakan, yaitu kinerja konstan (constant pressure) dan pemindahan
konstan (constant displacement). Pemindahan konstan dapat dibagi menjadi dua,
yaitu: pompa reciprocating dan pompa syringe. Pompa reciprocating menghasilkan
suatu aliran yang berdenyut teratur (pulsating),oleh karena itu membutuhkan
peredam pulsa atau peredam elektronik untuk, menghasilkan garis dasar (base
line) detektor yang stabil, bila detektor sensitif terhadapan aliran.
Keuntungan utamanya ialah ukuran reservoir tidak terbatas. Pompa syringe
memberikan aliran yang tidak berdenyut, tetapi reservoirnya terbatas.
II.6.2. Injektor
(injector)
Sampel
yang akan dimasukkan ke bagian ujung kolom, harus dengan disturbansi yang
minimum dari material kolom. Ada dua model umum :
a. Stopped Flow
b. Solvent
Flowing
Ada tiga tipe
dasar injektor yang dapat digunakan :
a. Stop-Flow:
Aliran dihentikan, injeksi dilakukan pada kinerja atmosfir, sistem tertutup,
dan aliran dilanjutkan lagi. Teknik ini bisa digunakan karena difusi di dalam
cairan kecil clan resolusi tidak dipengaruhi
b. Septum:
Septum yang digunakan pada KCKT sama dengan yang digunakan pada Kromtografi
Gas. Injektor ini dapat digunakan pada kinerja sampai 60 -70 atmosfir. Tetapi
septum ini tidak tahan dengan semua pelarut-pelarut Kromatografi Cair.Partikel kecil
dari septum yang terkoyak (akibat jarum injektor) dapat menyebabkan
penyumbatan.
c. Loop Valve:
Tipe injektor ini umumnya digunakan untuk menginjeksi volume lebih besar dari
10 μ dan dilakukan dengan cara automatis (dengan menggunakan adaptor yang
sesuai, volume yang lebih kecil dapat diinjeksifan secara manual). Pada posisi
LOAD, sampel diisi kedalam loop pada kinerja atmosfir, bila VALVE difungsikan,
maka sampel akan masuK ke dalam kolom.
II.6.3. Kolom
(Column)
Kolom
adalah jantung kromatografi. Berhasil atau gagalnya suatu analisis tergantung
pada pemilihan kolom dan kondisi percobaan yang sesuai. Kolom dapat dibagi
menjadi dua kelompok :
a. Kolom
analitik : Diameter dalam 2 -6 mm. Panjang kolom tergantung pada jenis material
pengisi kolom. Untuk kemasan pellicular, panjang yang digunakan adalah 50 -100
cm. Untuk kemasan poros mikropartikulat, 10 -30 cm. Dewasa ini ada yang 5 cm.
b. Kolom
preparatif: umumnya memiliki diameter 6 mm atau lebih besar dan panjang kolom
25 -100 cm.
Kolom
umumnya dibuat dari stainlesteel dan biasanya dioperasikan pada temperatur
kamar, tetapi bisa juga digunakan temperatur lebih tinggi, terutama untuk
kromatografi penukar ion dan kromatografi eksklusi. Pengepakan kolom tergantung
pada model KCKT yang digunakan (Liquid Solid Chromatography, LSC; Liquid Liquid
Chromatography, LLC; Ion Exchange Chromatography, IEC, Exclution
Chromatography, EC)
II.6.4. Detektor (Detector) .
Suatu
detektor dibutuhkan untuk mendeteksi adanya komponen sampel di dalam kolom
(analisis kualitatif) dan menghitung kadamya (analisis kuantitatif).Detektor
yang baik memiliki sensitifitas yang tinggi, gangguan (noise) yang rendah,
kisar respons linier yang luas, dan memberi respons untuk semua tipe senyawa.
Suatu kepekaan yang rendah terhadap aliran dan fluktuasi temperatur sangat
diinginkan, tetapi tidak selalu dapat diperoleh.
Detektor
KCKT yang umum digunakan adalah detektor UV 254 nm. Variabel panjang gelombang
dapat digunakan untuk mendeteksi banyak senyawa dengan range yang lebih luas.
Detektor indeks refraksi juga digunakan secara luas, terutama pada kromatografi
eksklusi, tetapi umumnya kurang sensitif jika dibandingkan dengan detektor UV.
Detektor-detektor lainnya antara lain:
Detektor
Fluorometer -Detektor Spektrofotometer Massa
Detektor
lonisasi nyala -Detektor Refraksi lndeks
Detektor
Elektrokimia -Detektor Reaksi Kimia
II.6.5. Elusi
Gradien
Elusi
Gradien didefinisikan sebagai penambahan kekuatan fasa gerak selama analisis
kromatografi berlangsung. Efek dari Elusi Gradien adalah mempersingkat waktu
retensi dari senyawa-senyawa yang tertahan kuat pada kolom. Dasar-dasar elusi
gradien dijelaskan oleh Snyder.
Elusi Gradien
menawarkan beberapa keuntungan :
a. Total waktu
analisis dapat direduksi
b. Resolusi
persatuan waktu setiap senyawa dalam campuran bertambah
c. Ketajaman
Peak bertambah (menghilangkan tailing)
d. Efek
sensitivitas bertambah karena sedikit variasi pada peak
Gradien
dapat dihentikan sejenak atau dilanjutkan. Optimasi Gradien dapat dipilih
dengan cara trial and error. Tabel 3. 1. berikut ini menunjukkan kompatibilitas
dari bermacam-macarn mode kromatografi cair dengan analisis gradien. Dalam
praktek, gradien dapat diformasi sebelum dan sesudah pompa.
Tabel
Mode Kompatibilitas dengan Gradien Mode
|
Solven
Gradien
|
Kromatografi
Cair padat (LSC)
|
Ya
|
Kromatografi
ekslusi
|
Tidak
|
Kromatografi
Penukar Ion (IEC)
|
Ya
|
Kromatografi
Cair Cair (LLC)
|
Tidak
|
Kromatografi
Fasa Terikat (BPC)
|
Ya
|
II.6.6. Pengolahan
Data (Data Handling)
Hasil
dari pemisahan kromatografi biasanya ditampilkan dalam bentuk kromatogram pada
rekorder. Suatu tipe Kromatogram dapat dilihat pada Gambar berikut ini
Dari Gambar .
waktu retensi dan volume retensi dapat diketahui /dihitung. Lni bisa digunakan
untuk mengidentifikasi secara kualitatif suatu komponen, bila kondisi kerja
dapat dikontrol. Lebar puncak dan tinggi puncak sebanding atau proporsional
dengan konsentrasi dan dapat digunakan untuk memperoleh hasil secara
kuantitatif.
II.6.7. Fasa
gerak
Di
dalam kromatografi cair komposisi dari solven atau rasa gerak adalah salah
satu dari
variabel yang mempengaruhi pemisahan. Terdapat variasi yang sangat luas pada
solven yang digunakan untuk KCKT, tetapi ada beberapa sifat umum yang sangat
disukai, yaitu rasa gerak harus :
1. Murni, tidak
terdapat kontaminan
2. Tdak bereaksi
dengan wadah (packing)
3. Sesuai dengan
defektor
4. Melarutkan
sampel
5. Memiliki
visikositas rendah
6. Bila
diperlukan, memudahkan "sample recovery"
7. Diperdagangan
dapat diperoleh dengan harga murah (reasonable price)
Umumnya,
semua solven yang sudah digunakan langsung dibuang karena prosedur pemumiannya
kembali sangat membosankan dan mahal biayanya. Dari semua persyaratan di atas,
persyaratan 1) s/d 4) merupakan yang sangat penting.
Menghilangkan gas (gelembung
udara) dari solven, terutama untuk KCKT yang menggunakan pompa bolak balik
(reciprocating pump) sangat diperlukan terutama bila detektor tidak tahan
kinerja sampai 100 psi. Udara yang terlarut yang tidak dikeluarkan akan
menyebabkan gangguan yang besar di dalam detektor sehingga data yang diperoleh
tidak dapat digunakan (the data may be useless). Menghilangkan gas (degassing)
juga sangat baik bila menggunakan kolom yang sangat sensitifterhadap udara
(contoh : kolom berikatan dengan NH2).
II.7.
KAFEIN
Kafeina, atau lebih
populernya kafein, ialah senyawa alkaloid xantina berbentuk kristal dan berasa pahit
yang bekerja sebagai obat perangsang
psikoaktif
dan diuretik ringan. Kafeina ditemukan oleh
seorang kimiawan Jerman, Friedrich Ferdinand Runge, pada tahun 1819.
Ia menciptakan istilah "kaffein" untuk merujuk pada senyawa kimia
pada kopi. Kafeina juga disebut guaranina
ketika ditemukan pada guarana, mateina
ketika ditemukan pada mate,
dan teina ketika ditemukan pada teh.
Semua istilah tersebut sama-sama merujuk pada senyawa kimia yang sama.
Kafeina dijumpai secara alami pada bahan pangan seperti biji
kopi,
daun
teh,
buah
kola,
guarana, dan maté.
Pada tumbuhan, ia berperan sebagai pestisida alami yang melumpuhkan dan
mematikan serangga-serangga tertentu yang memakan
tanaman tersebut. Ia umumnya dikonsumsi oleh manusia dengan mengekstraksinya
dari biji kopi dan daun teh.
Kafeina merupakan obat perangsang
sistem
pusat saraf pada manusia dan dapat
mengusir rasa kantuk secara sementara. Minuman yang
mengandung kafeina, seperti kopi, teh,
dan minuman ringan,
sangat digemari. Kafeina merupakan zat
psikoaktif yang paling banyak dikonsumsi di dunia. Tidak seperti zat
psikoaktif lainnya, kafeina legal dan tidak diatur oleh hukum di hampir seluruh
yuridiksi dunia. Di Amerika Utara, 90% orang dewasa mengonsumsi kafeina setiap
hari.
BAB III
METODE & HASIL PENELITIAN
III.I.
ALAT dan BAHAN
ü Labu
Ukur 100 mL
ü Labu
Ukur 50 Ml
ü Gelas
Piala 100 Ml
ü Labu
Semprot
ü Pengaduk
ü Corong
ü Kertas
Saring
ü Contoh
Kafein
ü Aquadest
ü Aquabidest
III.2.
CARA KERJA
- · Ditimbang sample caffeine sebesar 0,0213 gram
- · Sample dilarutkan dengan aqua bidestilat steril kedalam gelas piala 100 mL
- · Larutan sample dimasukkan kedalam labu ukur 100 mL, lalu dihimpitkan dengan aqua bidestilata steril dan dihomogenkan.
- · Dibuat larutan standar 5 ppm dari larutan induk yang telah dibuat dalam konsentrasi 200 ppm kedalam labu ukur 50 mL
- · Disaring larutan standar 5 ppm yang telah dibuat dengan menggunakan pompa vacuum
- · Larutan yang telah disaring dimasukkan kembali kedalam wadah labu ukur 50 mL
- · Larutan diinjeksi dengan menggunakan alat HPLC dengan microsyring sebanyak 20 mL
III.3.
PENGAMATAN
# Bobot
contoh yang ditimbang : 0,0263 gram
# Volume
Contoh : 50 ml
BAB
IV
PENUTUP
IV.I.
KESIMPULAN
Dari hasil percobaan
diatas dapat disimpulkan bahwa RT dari sampel kafein 5 ppm sebanyak 5 ml
sebesar 0,933 minutes dengan area= 21292, area% = 8,92,height=2922 ,height
%=45,59
DAFTAR PUSTAKA
·
chemistry.org
·
FARMASY-EFFENDY2.PDF
·
http//.wikipedia.kafein